Analiza javnih podatkov
Podatki o rodovih SARS-CoV-2 in datum odvzema vzorca iz sekvenc, ki so na voljo iz Čila, so bili pridobljeni s spletnega mesta Consorcio Genomas CoV2, ki je na voljo na https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Podatki o cepljenju so bili pridobljeni iz javnih podatkov Ministrstva za znanost, tehnologijo, znanje in inovacije, ki so na voljo na https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Izdelek 83).
Test okužbe
Psevdotipizirani virusi, ki nosijo različne proteine SARS-CoV-2, so bili pripravljeni, kot smo prej opisali12. Na kratko, psevdotipi SARS-CoV-1 na osnovi HIV-2 so bili proizvedeni v celicah HEK293T s transfekcijo pNL4.3-ΔEnv-Luc skupaj z ustreznim kodirajočim vektorjem pCDNA-SARS-CoV-2 v molskem razmerju 1: 1. Plazmidi, ki kodirajo konico, optimizirano za kodon, nimajo zadnjih 19 aminokislin C-terminalnega konca (SΔ19), za katere je znano, da se izognejo zadrževanju na endoplazmatskem retikulumu12 so bili pridobljeni s sintezo genov ali prilagojeno spletno usmerjeno mutagenezo (GeneScript) in so vsebovali naslednje mutacije: rod A (referenčno zaporedje), rod B (D614G), rod B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), linija P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) in linija C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Vsak psevdotipni pripravek smo očistili s centrifugiranjem pri 859 vrtljajih na minuto pri sobni temperaturi, količinsko opredelili s kompletom kvantikin ELISA kompleksa HIV-3,000 Gag p1 (R&D Systems), alikvotirali v 24% fetalnem govejem serumu (Sigma-Aldrich) in shranili pri -50 ° C do uporaba. Za okužbo celic HEK-ACE80 so bile uporabljene različne količine psevdotipiziranih virusov (kot je določeno z ravnjo proteina HIV-1 p24), 2 ur kasneje pa je bila aktivnost luciferaze kresnice izmerjena z uporabo reagenta za analizo luciferaze (Promega) v mikroploščici Glomax 48 luminometer (Promega).
Nevtralizacijski test
Psevdotipizirani testi nevtralizacije virusov so bili izvedeni v bistvu, kot smo prej opisali12. Na kratko smo serijske razredčitve vzorcev plazme (1: 4 do 1: 8748) pripravili v DMEM z 10% fetalnim govejim serumom in inkubirali s 5 ng p24 vsakega psevdotipiziranega virusa v 1 uri pri 37 ° C in nato 1 × 104 celic HEK-ACE2 dodamo v vsako jamico. Celice HEK293T (ki ne izražajo ACE2), inkubirane s psevdotipiziranim virusom (linija A), smo uporabili kot negativno kontrolo. Celice smo 48 ur kasneje lizirali in aktivnost luciferaze kresnice izmerili z uporabo reagenta za analizo luciferaze (Promega) v luminometru Glomax 96 Microplate (Promega). Izračunali smo odstotek nevtralizacije za vsako redčenje in izračunali ID50 vsakega vzorca z uporabo GraphPad Prism različice 9.0.1.
Statistične analize
Statistične analize so bile izvedene z uporabo programske opreme GraphPad Prism različice 9.1.2. Večkratne primerjave skupin za nevtralizacijo titrov protiteles (NAbT) proti skupini psevdotipiziranih virusov SARS-CoV-2 ter primerjave odzivov NAbs po spolu in statusu dima so bile izvedene s parnim Wilcoxonovim podpisanim testom. Faktorska sprememba je bila izračunana kot razlika geometrijskega srednjega titra v ID -ju50 v primerjavi z virusom psevdotipiziranega tipa Wild. Korelacijska analiza med NAbT in starostjo ali BMI je bila izvedena s Spearmanovim testom. Za statistično analizo nalezljivosti sta bila izvedena enosmerna ANOVA in Tukeyjev večkratni primerjalni test. Vrednost p ≤ 0.05 je veljala za statistično pomembno.
Etična odobritev
Študijski protokol sta odobrila Odbor za etiko Medicinske fakultete Univerze v Čilu (projekti št. 0361-2021 in št. 096-2020) in Clínica Santa Maria (projekt št. 132604-21). Vsi darovalci so podpisali informirano privolitev, njihovi vzorci pa so bili anonimizirani.
Vpliv konjskih mutacij v varianti Lambda na infektivnost in odziv nevtralizirajočih protiteles
Analiza 3695 zaporedij iz Čila, deponiranih pri GISAID 24. junijath 2021 kaže očitno prevlado različic SARS-CoV-2 Gama in Lambda v obračunu zadnjega trimesečja skupaj za 79% vseh zaporedij.
Zanimivo je, da je za to obdobje značilna množična akcija cepljenja, v kateri je 65.6% ciljne populacije (18 let in starejših) do 27. junija prejelo celotno shemo cepljenja.th 2021
Glede na to, da je 78.2% ljudi, cepljenih s popolno shemo, prejelo inaktivirano virusno cepivo CoronaVac iz podjetja Sinovac Biotech, smo poskušali raziskati vpliv konjskih mutacij, prisotnih v varianti Lambda, na nevtralizacijsko sposobnost protiteles, ki jih povzroča to cepivo.
V ta namen smo ustvarili psevdotipizirane viruse SARS-CoV-1 na osnovi virusa HIV-2, ki prenašajo beljakovinski protein iz referenčne linije Wuhan-1 (divji tip; linija A), mutacije D614G (linija B) in alfa (linija B .1.1.7), različici Gamma (linija P.1) in Lambda (linija C.37).
Med pripravo virusa smo dosledno opazili, da so celice, okužene s psevdotipiziranim virusom, ki nosi Lambda konico, dale bistveno višje vrednosti bioluminiscence v primerjavi z mutantom D614G ali različicami alfa in gama, kar kaže na povečano infektivnost, ki jo povzroča beljakovina lambda konice
Slika 1.Nalezljivost, ki jo posredujejo različni proteini.
(A) Shematski prikaz proteina SARS-CoV-2 in variant, uporabljenih v tej študiji. Linije so navedene v oklepaju. RBD, receptorsko vezavna domena, CM; citoplazemski rep.
(B) Titracija psevdotipov vsake vrste z uporabo enakovrednih količin HIV-1 p24. Aktivnost luciferaze kresnice smo merili kot relativne luminiscenčne enote (RLU) 48 ur po okužbi. Povprečje in SD sta bila izračunana iz reprezentativnega trojnega poskusa.
Nato smo uporabili zgoraj omenjene psevdotipizirane viruse za izvedbo nevtralizacijskih testov z uporabo 79 vzorcev plazme zdravih zdravstvenih delavcev iz Universidad de Chile in Clínica Santa María v Santiagu v Čilu.
Izločili smo 4 vzorce, saj nismo mogli izračunati titra ID50. Iz analiziranih vzorcev je 73% ustrezalo ženskam, povprečna starost 34 let (IQR 29 - 43) in indeks telesnega maksimuma (BMI) 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% udeležencev se je med trajanjem imunizacije izjavilo, da so aktivni kadilci. Vzorci so bili pridobljeni v povprečju 95 dni (IQR 76 - 96) po drugem odmerku cepiva CoronaVac
Opazili smo, da je nevtralizacija psevdotipiziranega virusa, ki nosi beljakovino divjega tipa, povzročila 50% inhibitorno redčenje (ID50) povprečni titer 191.46 (154.9 - 227.95, 95% IZ,), medtem ko je bil 153.92 (115.68 - 192.16, 95% IZ), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% IZ), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% IZ ) in 78.75 (49.8 - 107.6, 95% IZ) za psevdotipizirane viruse, ki prenašajo spike protein iz mutanta D614G oziroma različice alfa, gama in lambda.
Opazili smo tudi, da je geometrijski srednji titer ID -ja50 titri so se zmanjšali za faktor 3.05 (2.57 - 3.61, 95% IZ) za psevdotipiziran virus, ki nosi Lambda konico, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% IZ) za konico gama, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% IZ) za konico Alpha in 1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) za konico D614G v primerjavi s konico Wild.
V naši kohorti študije niso opazili korelacije med spolom, starostjo, indeksom telesne mase (ITM) ali stanjem kajenja in nevtralizirajočimi titri protiteles.
Slika 2.Nevtralizacijski test z vzorci plazme cepljenih proti CoronaVac
(A) Spremembe recipročnega 50 -odstotnega nevtralizacijskega titra (ID50) v vzorcih plazme 75 prejemnikov cepiva CoronaVac proti D614G (linija B), Alpha (linija B.1.1.7),
Različici gama (linija P.1) in lambda (linija C.37) v primerjavi z virusom divjega tipa. Rezultati so prikazani kot razlika v nevtralizacijskih titrih ujemajočih se vzorcev. P vrednosti za primerjavo ID -ja50 se izračunajo s Wilcoxonovim podpisanim testom.
(B) Okvirne ploskve nakazujejo mediano in interkvartilno območje (IQR) ID50 za vsak psevdotipiziran virus. Faktorske spremembe so prikazane kot razlika povprečnega geometrijskega titra v ID -ju50 v primerjavi s tistimi za virus psevdotipnega tipa Wild. Statistične analize so bile izvedene z Wilcoxonovim testom podpisanega ranga ujemajočih se parov.
Naši podatki so skupaj pokazali, da beljakovinski protein novo priznane zanimive različice Lambda, ki močno kroži v Čilu in južnoameriških državah, nosi mutacije, ki dajejo povečano infektivnost in sposobnost pobega iz nevtralizirajočih protiteles, ki jih povzroča CoronaVac.
